Năm 1899, chính quyền thuộc địa Pháp có sự thay đổi lớn về sắp xếp các đơn vị hành chánh. Ngày 1 tháng 11, Pháp lập sở Tham Biện Đồng Nai Thượng (Haut Donnai). Một phần đất  vùng Định Quán của Biên Hoà bị cắt nhập vào Đồng Nai Thượng Ngày 20 tháng 12 năm 1899, Toàn quyền Đông Dương ra Nghị định đổi các địa hạt Tham biện ở Nam Kỳ thành tỉnh. Tỉnh Biên Hòa thành lập trên cơ sở địa hạt Biên Hòa.

Năm 1901, tỉnh lỵ Biên Hòa đặt tại xã Bình Trước (tức thành phố Biên Hòa ngày nay), gồm 15 tổng, 151 làng. Một số tư liệu cho biết thêm: “Toàn tỉnh có diện tích trồng lúa là 26.373 ha; hệ thống đường bộ có chiều dài 399,2 km (quốc lộ 52,1 km, tỉnh lộ 100,3 km, hương lộ 264,8 km, đường cán đá 156,7 km, đường đất 242,5 km); tổng chiều dài các cầu là 1.832 m. Có 98 địa điểm khai thác đá xanh, 150 điểm khai thác đá ong, 17 lò gạch, 21 lò rèn, 80 trại cưa gỗ, 4 trại đóng ghe, 9 khu rừng cấm”.

Năm 1903, Tòan quyền Đông Dương thành lập quận Chứa Chan gồm 4 tổng người dân tộc thiểu số ở tỉnh Biên Hòa.  Năm 1912, quận Xuân Lộc được thành lập, gồm 3 tổng: Bình Lâm Thượng, Phước Thành, An Viễn. Năm 1924, tỉnh Biên Hòa có 17 tổng, 172 làng. Mạng lưới giao thông đường sá dài 713,5 km (trong đó quốc lộ chiếm 151,6 km, tỉnh lộ 287,8 km, hương lộ 278,1 km, đường rải nhựa 161,8 km, đường cán đá 405,7 km, đường đất 146 km). Tổng chiều dài các cầu là 3.541 m (cầu sắt 931m, cầu gỗ 2.610 m ).

Năm 1925, quận Chứa Chan bị bãi bỏ, thành lập hai quận Phú Riềng và Võ Đắc ở tỉnh Biên Hòa. Năm 1927, quận lỵ Phú Riềng chuyển về Bù Khoai và đổi tên là quận Sông Bé, quận lỵ Võ Đắc chuyển về Xuân Lộc và đổi tên là quận Xuân Lộc; lập quận Đồng Nai, lỵ sở đặt tại Thanh Sơn. Tỉnh trưởng Biên Hòa là Pierre Marty. Năm 1928, thành lập quận Châu Thành ở tỉnh lỵ Bình Trước và quận Tân Uyên với trị sở tại chợ Tân Uyên.

Năm 1936, tỉnh Biên Hòa có diện tích là 11.044 km²  . Năm 1939, tỉnh Biên Hòa có 5 quận với 16 tổng, 119 xã; gồm: quận Châu Thành (3 tổng: Chánh Mỹ Thượng, Phước Vinh Trung, Phước Vinh Thượng); quận Long Thành (3 tổng: Long Vĩnh Thượng, Thành Tuy Thượng, Thành Tuy Hạ); quận Xuân Lộc (4 tổng: Bình Lâm Thượng, An Viễn, Tập Phước, Phước Thành); quận Tân Uyên (3 tổng Phứơc Vinh Hạ, Chánh Mỹ Trung, Chánh Mỹ Ha ) và quận núi Bà Rá (4 tổng: Bình Cách, Thuận Lợi, Tân Thuận, Bình Tuy). Diện tích Biên Hòa là 11.234 km², trong đó diện tích trồng lúa là 44.200 ha. Dân số có 166.000 người với mật độ trung bình 14 người trên 1 km²_.

Năm 1943, dân số tỉnh Biên Hòa là 183.000 người, trong đó người Việt 139.000 người, người Hoa 3.000 người, người Pháp 580 người, các dân tộc thiểu số chiếm 40.000 người.